成年女人免费视频播放体验区_综合欧美日韩国产成人_av色图_香蕉碰碰人人a久久亚洲精品国产AV成拍色拍_中字专区中文字幕视频

在 WB 和 IP 實(shí)驗(yàn)中，破碎細(xì)胞或組織與選擇和配制裂解液一樣重要。比起一些更軟的組織（如腦組織），在準(zhǔn)備 WB 或 IP 的樣品時(shí)，緊密的纖維組織（如肌肉組織）需要更劇烈的方法；對(duì)于培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞系，在準(zhǔn)備 WB 和 IP 的樣品時(shí)需要一定的機(jī)械攪拌去提取蛋白。機(jī)械破碎樣品常規(guī)的方法和設(shè)備如下：

組織高速勻漿儀

通常破碎體積大的植物或者動(dòng)物組織需要用可旋轉(zhuǎn)、帶有刀片的勻漿儀或者攪拌器 .這些儀器通常通過(guò)一個(gè)電動(dòng)的馬達(dá)帶動(dòng)不銹鋼可旋轉(zhuǎn)切割刀片，可以從頂部或者底部啟動(dòng)，這個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生很少熱量，但是樣品需要置于冰上。勻漿儀的轉(zhuǎn)速和刀片的尺寸，需要根據(jù)樣品的體積和組織大小來(lái)確定。大部分勻漿儀產(chǎn)生的顆粒較大，然而，一些帶特殊旋轉(zhuǎn)刀片的勻漿儀可以切割產(chǎn)生小到 4 微米且一致的顆粒，這種破碎對(duì)于一些小的單細(xì)胞樣本（如細(xì)菌、酵母）效果不明顯，但是對(duì)于大塊的、骨質(zhì)的、纖維較多的樣本特別適用。

研缽和研磨勻漿器

研磨勻漿器特別適合軟組織和細(xì)胞懸液，它是由一個(gè)不銹鋼或玻璃的活塞樣槌頭和一個(gè)玻璃槌管組成，勻漿器槌頭表面和槌管壁是磨砂面的，以提高研磨的效果。槌頭在管底部的縫隙通常是幾百微米，小的組織（通常被切割成 1 mm 的小段）放在槌管底部，同時(shí)加有預(yù)冷的少量裂解液，槌頭在勻漿槌管中旋轉(zhuǎn)可以使小的組織碎片粉碎。某些組織研磨相關(guān)儀器也會(huì)加入玻璃粉，氧化鋁珠或細(xì)沙去增強(qiáng)樣品的粉碎。

值得注意的是，在加入裂解液之前，一般陶瓷或者石制的研磨缽和冷凍過(guò)的研磨棒可以用來(lái)磨碎部分已經(jīng)用液氮?jiǎng)舆^(guò)的固體組織。其他更進(jìn)一步的組織粉碎的方法可以與冷凍研磨一起合用。

超聲破碎

超聲破碎一般是用超聲波的能量（大于 20 kHz）去破壞蛋白復(fù)合物、細(xì)胞器和細(xì)胞膜。超聲波的能量會(huì)產(chǎn)生很多微氣泡，這些氣泡可以?xún)?nèi)爆并產(chǎn)生沖擊波，也稱(chēng)作氣穴作用。氣穴作用產(chǎn)生的機(jī)械壓力可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白復(fù)合物。超聲破碎是有效的切割染色質(zhì)方法，可以有效提升樣品中蛋白質(zhì)的可溶性，特別是完整的核蛋白和染色質(zhì)相關(guān)蛋白的有效裂解都需要樣品的超聲處理。需要注意的是，盡管之前在樣品制備的過(guò)程中可能用其他的方法勻漿處理過(guò)，CST 仍然推薦補(bǔ)加超聲步驟處理所有樣品。

超聲的方法有兩種：直接法和間接法。直接法是超聲儀的探頭直接插入樣本中，而間接法是通過(guò)水浴這個(gè)介質(zhì)將超聲波能量的傳遞到樣品管直至樣品內(nèi)部，這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：

1、直接（利用探頭）超聲

帶有探頭的超聲儀非常廣泛的用于小和中量樣本制備中。這種超聲儀的基本單元，通過(guò)電線與圓柱轉(zhuǎn)換器的連接產(chǎn)生高壓脈沖。轉(zhuǎn)換器把電能轉(zhuǎn)化成超聲波振動(dòng)，這種超聲振動(dòng)被放大，并通過(guò)實(shí)體的探頭傳遞到液體裂解樣品中。

有效超聲所需振動(dòng)能量的優(yōu)化（放大倍數(shù)/超聲強(qiáng)度）取決于樣本的體積和超聲探頭的大小。如果裂解液體積太小，探頭沒(méi)有足夠浸沒(méi)在液體中，或者探頭太大、超聲儀設(shè)置的頻率太高，樣本可能會(huì)在超聲過(guò)程中產(chǎn)生氣泡，影響超聲效果。

選擇合適的探頭也很重要，當(dāng)液體的體積在 1-5 ml 之間， 很多超聲廠商推薦使用直徑為 3 mm 的探頭。如果用很小的探頭（小于 3 mm），并把探頭放于樣品較深的位置，將導(dǎo)致超聲破碎樣本效果大打折扣。

長(zhǎng)時(shí)間的超聲過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)導(dǎo)致樣品變性或者降解。為了阻止樣本過(guò)熱，超聲過(guò)程中需要將樣品管放在冰浴中，每次超聲處理一段時(shí)間后需要在冰上暫停一段時(shí)間，用來(lái)減少熱量的產(chǎn)生，每次超聲的時(shí)間也可以?xún)?yōu)化。更多的超聲儀可以設(shè)置時(shí)間、強(qiáng)度、暫停時(shí)間、重復(fù)超聲次數(shù)等參數(shù)并儲(chǔ)存為程序，以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)超聲。CST 只用帶探頭的超聲儀去準(zhǔn)備樣品，當(dāng)處理 1 ml 的樣品時(shí)，用 3 mm 的探頭。我們一般推薦使用 35%-40% 的zui大功率進(jìn)行 3 次超聲脈沖，每次超聲時(shí)間 10 秒， 每次超聲之間停頓 10 秒，不同的儀器可以調(diào)整zui大功率水平在 200W 左右。

2、間接（水?。┏?/strong>

水浴超聲的能量是通過(guò)水傳遞到樣品的內(nèi)部，可以同時(shí)做多個(gè)樣品。因?yàn)椴恍枰獦颖九c探針的匹配，因此樣本可以在無(wú)菌的條件下操作，避免探頭造成污染，還可以避免樣本在超聲中過(guò)熱。這個(gè)方法比較適合高通量的實(shí)驗(yàn)，或者小體積的樣本，因?yàn)轶w積小使用直接超聲會(huì)產(chǎn)生氣泡。間接超聲沒(méi)有直接超聲那么有效，可以多做幾次間接超聲來(lái)提高樣品破碎的效果。當(dāng)樣本數(shù)量不多時(shí)，直接超聲裂解還是很有效的。

3、用帶針頭的注射器進(jìn)行破碎

如果沒(méi)有探頭超聲儀，可以用細(xì)的注射器針頭破碎樣本，也可以破環(huán)細(xì)胞膜并切割核染色質(zhì)。針頭抽吸樣品產(chǎn)生的機(jī)械壓力，可以破碎細(xì)胞膜、細(xì)胞器和核蛋白復(fù)合物。首先，將樣本用裂解液重懸后，先用粗一些的針頭（如 10 ml 注射器針頭）進(jìn)行多次吹吸，再換成更小的的針頭繼續(xù)吹吸，直到樣品粘稠度明顯下降，整個(gè)過(guò)程需要在冰上操作。